O papel regulatório de NF-ΚB e TWIST1 no câncer de mama

Abstract

O câncer de mama (CM) é uma doença heterogênea, composta por múltiplos subtipos com características moleculares e comportamentos distintos. No Brasil, esta neoplasia é a primeira causa de morte por câncer em mulheres, principalmente devido ao diagnóstico tardio, quando a possibilidade do desenvolvimento de metástases é maior. A alta expressão de receptores de estrógeno (ER) e/ou progesterona (PR) caracteriza o subtipo Luminal, enquanto a amplificação gênica e/ou a alta expressão de HER2, caracteriza o subtipo HER2. Quando nenhum destes três receptores é expresso, o tumor é denominado Triplo Negativo (TN), sendo o mais agressivo de todos os subtipos. O processo metastático depende da expressão de fatores de transcrição (TFs) como Twist1, Snail, Slug e Sip1, envolvidos com a transição epitélio-mesenquimal (EMT). O objetivo deste trabalho foi avaliar o papel de NF-κB como regulador dos TFs associados à EMT. Por meio de ferramentas de bioinformática, identificamos sítios de ligação para NF-κB na região promotora destes genes, cujas ligações foram confirmadas in vitro por imunoprecipitação de cromatina. Fusões entre a região de ligação de NF-κB ao DNA e o gene reporter Luciferase confirmaram a atividade da região promotora descrita, confirmando o papel de NF-κB como regulador da expressão gênica destes TFs nas células agressivas de CM. Em 46 amostras de pacientes com CM, o grupo TN expressou os maiores níveis de mRNA de Slug e Sip1, em relação aos subtipos Luminal e HER2. No entanto, o grupo HER2 expressou os maiores níveis de Twist1. Este fator de transcrição é descrito como o principal regulador da EMT no CM, embora seu papel nos subtipos intrínsecos ainda não esteja esclarecido. O silenciamento do gene TWIST1 na linhagem celular HCC-1954 (Her2/neu positivo) causou uma redução drástica na sua expressão, o que foi confirmada por RT-qPCR e immunoblotting. Uma análise de expressão em larga escala por microarranjo através do GeneChip human exon array mostrou profundas alterações moleculares provocadas pelo knockdown de TWIST1, pois 141 genes apresentaram a expressão aumentada e 190 diminuída. Análises in silico realizadas no software MetaCore, agruparam esses genes de acordo com a função molecular, revelando inúmeras correlações entre Twist1 com importantes processos biológicos e vias de sinalização como: remodelamento de matriz extracelular, coagulação sanguínea, sinalização de Th17, entre outros. Os genes mais relevantes diferencialmente expressos foram confirmados por RT-qPCR. A sinalização da Interleucina (IL)-17 foi examinada por citometria de fluxo e immunoblotting para as proteínas IL-17RA e Act1, que atuam no disparo desta sinalização, e os níveis de IL-6 e IL-8, que são alvos da sinalização mencionada, foram avaliados através de ensaios de ELISA. Ambos resultados mostraram informações condizentes com as análises de microarranjo, relatando que Twist1 tem um papel importante para ativação de um perfil Th17 no contexto do câncer de mama. Dessa forma, nossos achados contribuem para uma melhor compreensão da participação de NF-κB e Twist1 no câncer de mama, sobretudo nos subtipos Her2 e TN, demonstrando seus potenciais como alvos para o desenvolvimento de novas terapias.