Aspectos funcionais das mutações de neoplasias mieloides: um estudo de modelagem in vitro baseado em edição genética por CRISPR/Cas9

Abstract

Indivíduos normais, em sua grande maioria, idosos acima de 65 anos de idade, podem apresentar nas células do sangue periférico mutações somáticas relacionadas à etiopatogênese das malignidades mieloides. Esse fenômeno, nomeado de hematopoese clonal do idoso, está associado ao risco aumentado para o desenvolvimento de neoplasias sanguíneas, o que leva a crer que essa seja uma condição pré-leucêmica. Alguns dos genes acometidos possuem função de regulação epigenética ou atuam na edição do RNA mensageiro (splicing). Até o momento, há poucas evidências sobre o papel funcional desses marcadores na carcinogênese, o que motiva os estudos baseados em modelagem das doenças malignas do sangue, sobretudo, na era da edição genômica. Com este intuito, foi realizado no presente projeto de tese a geração e o estabelecimento de clones celulares, provindos da linhagem hematopoética K562, editados geneticamente para os alvos DNMT3A (R882H), TET2, SF3B1 (K700E) e SRSF2 (P95H). Uma linhagem estável com expressão indutível de eCas9 e EGFP foi gerada, e a partir dela, foram realizadas transfecções subsequentes com os gRNAs específicos para a edição dos genes de interesse. A presença de mutações nos marcadores epigenéticos (DNMT3A e TET2) e SRSF2 não alteraram a habilidade proliferativa, comparadas às células WT, ao passo que a mutação SF3B1 K700E reduziu o crescimento dessas células. Esses dados foram confirmados por ensaio de competição clonal in vitro e in vivo, realizados em camundongos NSG. Além de impactar na viabilidade celular, a mutação em SF3B1 atribuiu resistência ao estresse genotóxico induzido por radiação gama. O mesmo comportamento não foi observado em células SRSF2 P95H, demonstrando que o fenótipo de resistência parece ser gene-específico. Mudanças nos níveis de morte por apoptose e presença de sideroblastos em anel, figura displásica relacionada a mutações no gene SF3B1, não foram observados em clones K562 editados para o gene. Em contrapartida, células com mutações em genes do spliceossoma (SF3B1, SRSF2 e U2AF1) apresentaram expressão aumentada da citocina IL-8, confirmada por ELISA e qRT-PCR. Ensaios de co-cultura entre clones K562 SF3B1 WT e K700E em presença de IL8 e/ou IL-1a mostraram que as citocinas não interferiram na capacidade proliferativa dessas células. Esses resultados foram semelhantes aos obtidos com o co-cultivo desses clones com células estromais obtidas a partir de amostras de medula óssea de indivíduos saudáveis ou acometidos com malignidade hematológica. A presença de mutações co-ocorrentes (TET2 e SF3B1) diminuíram a habilidade proliferativa dos clones afetados, além de induzir eritropoese espontânea in vitro. Em conclusão, nossos dados sugerem que a mutação K700E no gene SF3B1 foi capaz de impactar na sobrevivência e na expressão de IL-8, citocina já contextualizada, anteriormente, com neoplasias da linhagem mielóide, em especial, as síndromes mielodisplásicas. Além disso, a geração desses modelos in vitro permitirá o melhor entendimento da relação biológica entre esses marcadores genéticos e a fisiopatologia de doenças malignas do sangue.