Células tronco de pluripotência induzida (iPSCs) como modelo de estudo de mutações somáticas das neoplasias mieloides

Abstract

A mielofibrose primária (MF) é caracterizada por uma mieloproliferação aumentada e fibrose da medula óssea. Na MF, as mutações somáticas driver ocorrem nos genes JAK2, MPL ou CALR e mutações em reguladores epigenéticos como TET2 e ASXL1, que podem levar à perda de função. Neste contexto, as células tronco de pluripotência induzida (iPSCs) podem ser usadas para estudar a heterogeneidade clonal, recapitular in vitro o fenótipo da doença e em testes para a eficácia de fármacos. O objetivo principal deste trabalho foi avaliar o impacto das mutações somáticas na CALR e nos reguladores epigenéticos tanto na reprogramação celular como na diferenciação hematopoiética usando iPSCs. As mutações em CALR foram caracterizadas por PCR e eletroforese capilar, e as mutações somáticas nos outros genes foram caracterizadas pelo sequenciamento de próxima geração. Neste estudo, geramos células iPSC a partir de células primárias CD34+ de pacientes (P) nomeados de P1 a P6 e dois controles de doadores saudáveis (C1/C2) usando o sistema baseado em vírus Sendai. O estado de pluripotência foi avaliado pela expressão de marcadores de células estaminais embrionárias (OCT-3/4, Sox-2, SSEA-4 e TRA-1-81) e a capacidade de se diferenciar em todas as três camadas germinativas nos ensaios de formação de corpos embrioides. Os marcadores de células-tronco e das camadas germinativas foram detectados por imunofluorescência. A diferenciação hematopoiética foi realizada em culturas feeder-free, suplementada com citocinas. Os progenitores CD43+ CD34+

foram classificados no dia 10 e 14 e plaqueados em metilcelulose ou em ensaios de coagulação plasmática para quantificar unidades de formação de colônias (CFU) ou CFU-megacariocítica (CFU-MK), respectivamente. Os granulócitos foram diferenciados dos progenitores CD34+ /CD43+ durante uma cultura de 25 dias. Após a reprogramação, realizamos uma caracterização molecular dos iPSCs derivados de P1-P6. A partir de P4, foram obtidos 32 clones de iPSCs e foram identificados dois genótipos diferentes, CALRins5/ TET2wt (n = 20) e CALRins5/TET2G989X (n = 12). Os diferentes genótipos observados para P4-iPSC refletem a diversidade clonal presente na amostra primária de MF. Confirmamos que TET2 WT, bem como o iPSCs carreando TET2 mutado formam bona fide iPSCs, indicando que a mutação G898X não prejudicou a reprogramação celular. Procuramos, em seguida, estudar o papel dessas mutações na diferenciação hematopoiética. O potencial clonogênico dos progenitores foi confirmado pela formação de todos os tipos de CFU mieloide em ensaios de metilcelulose. Usando o teste do coágulo de plasma, observamos maiores números de colônias grandes CFU-MK (> 50 células) derivadas de clones P1-iPSC vs C1/C2-iPSC. Além disso, observamos um número crescente de colônias de monócitos derivadas de progenitores CD34+ /CD43+ de iPSCs mutantes TET2 (CALRins5/TET2G989X) quando comparados com iPSCs CALRins5/TET2WT e iPSC do doador controle CALRWT/TET2WT. Além disso, os iPSCs portadores de CALR mutante foram associados a colônias de MK maiores consistentes com o fenótipo observado em pacientes com MF. Neste estudo, nossos resultados sugerem que mutações em reguladores epigenéticos como o TET2G898X não parecem prejudicar a reprogramação celular, já que os iPSCs que abrigavam essas mutações apresentavam todas as características dos bona fide iPSC e que as mutações em CALR e TET2 parecem afetar a diferenciação hematopoiética de iPSCs.