Identificação de variantes em genes relacionados ao câncer de mama hereditário por sequenciamento de nova geração

Abstract

BRCA1 e BRCA2 são os principais genes de suscetibilidade ao câncer hereditário de mama e ovário. Ambos codificam proteínas extensas, o que faz do sequenciamento pelo método de Sanger um processo laborioso e dispendioso. Além disso, outros genes estão associados ao surgimento do fenótipo. As novas tecnologias de sequenciamento possibilitam analisar múltiplos genes e amostras de forma simultânea, agilizando o processo e com custo cada vez menor. Este trabalho teve como objetivo estabelecer uma estratégia de sequenciamento de regiões alvo baseada em multiplex-PCR e long range PCR (LR-PCR) para o sequenciamento de nova geração (NGS), para nove genes associados ao câncer de mama hereditário, e utilizá-los na identificação de variantes germinativas em pacientes com critérios clínicos para câncer hereditário de mama. Foram selecionados 96 pacientes com base nos critérios clínicos da National Comprehensive Cancer Network, e divididos em dois grupos. O primeiro grupo foi composto por 25 pacientes portadores de variantes deletérias nos genes BRCA1 ou BRCA2 previamente identificadas pelo sequenciamento de Sanger. Este grupo foi sequenciado pelo NGS para os genes BRCA1 e BRCA2, visando validar a metodologia. O segundo grupo foi composto por 71 pacientes negativos para variantes patogênicas nos genes BRCA1 e BRCA2. Este grupo teve por objetivo avaliar a prevalência de mutações nos genes ATM, CHEK2, CDH1, PALB2, PTEN, RAD51D e TP53. Seis LR-PCR foram padronizadas para o gene BRCA1, e 6 multiplex-PCR para o gene BRCA2. O sequenciamento do grupo 1 foi realizado em dois experimentos. No primeiro, foi observada uma variação acentuada de cobertura entre os amplicons, 7,3% deles apresentaram cobertura <27x. No segundo experimento, após os ajustes no protocolo, apenas 1,53% dos amplicons apresentaram cobertura <27x, e a dispersão da cobertura foi menor. Entre as 241 variantes identificadas pelo método de Sanger, 238 foram corretamente identificadas pelo NGS, resultando em uma sensibilidade de, valor preditivo positivo e concordância de 94,8%, 97,9% e 91,9%, respectivamente. Para as amostras do segundo grupo 22 PCR foram padronizadas. A cobertura das regiões alvo foi de 97%. Foram identificada 689 variantes, 110 diferentes entre si: 78 benignas e 31 variantes de significado incerto (VUS). A ausência de variantes comprovadamente patogênicas nesse grupo pode se dever a uma série de fatores: critérios inapropriados de seleção dos pacientes, pequeno número de amostras avaliadas, ou a presença de variantes em regiões não cobertas. Entre as VUS identificadas no presente trabalho 13 delas foram preditas como potencialmente patogênicas por pelo menos 3 programas de predição, e podem ter associação com o surgimento do câncer nos pacientes. O protocolo de obtenção das regiões alvo demonstrou ser adequado, tendo em vista a cobertura elevada obtida para essas regiões nos dois grupos. As medidas de sensibilidade, concordância, e valor preditivo positivo alcançados demonstram que o pipeline de análises é adequado na identificação de variantes nos genes associados ao câncer hereditário de mama.