Avaliação do papel de CDK9 no reparo de danos ao DNA e controle do ciclo celular

Abstract

A via de resposta a danos ao DNA (RDD) é composta por uma cascata coordenada de sinalizações capaz de perceber e reparar diferentes tipos de lesões no DNA. As quebras de duplas fita do DNA ativam o eixo da RDD modulado por ATM-CHK2, que é responsável pela parada do ciclo celular, possibilitando o reparo da molécula. Esse tipo de dano é resolvido majoritariamente por dois mecanismos distintos: o reparo por recombinação homóloga (Homologous Recombination - HR) e o reparo não homólogo por junção de pontas (Non-homologous End-joinning - NHEJ). As proteínas BRCA1 e 53BP1 desempenham um papel importante na RDD através do direcionamento do reparo por HR ou NHEJ, porém o mecanismo exato que modula ambas as respostas não está completamente elucidado. Anteriormente, nosso grupo identificou a cinase dependente de ciclina 9 (CDK9) como uma possível parceira de interação de BRCA1 e BARD1 (BRCA1-associated RING domain 1). CDK9 é um componente do complexo de alongamento da transcrição e sua atividade está relacionada à manutenção da integridade genômica na resposta ao estresse replicativo e no reparo por HR através do recrutamento de BRCA1 aos sítios de quebra de dupla fita. Nesse trabalho demonstramos que a formação de focos de RAD51 mediante radiação ionizante não ocorre na ausência de CDK9, porém o mesmo não é observado para 53BP1. As células deficientes para CDK9 apresentam uma maior sensibilidade à inibição de PARP. Nossos resultados sugerem que a interação entre CDK9 e BRCA1 (através da porção N-terminal de BRCA1) é dependente da formação do heterodímero BRCA1/BARD1. E que o mutante E369A de CDK9, incapaz de interagir com a região C-terminal de BRCA1, não interfere no papel de CDK9 na transcrição: preservando a capacidade de fosforilação da cauda CTD da RNA polimerase II, bem como não alterando o perfil de ativação mediante fosforilação de sua alça T. Entretanto, o mutante E369A não é capaz de reestabelecer o recrutamento de BRCA1 para os sítios de danos ao DNA. Além disso, caracterizamos CHK2 como nova parceira de interação com CDK9 através de ensaios de interação proteína-proteína valendo-se de proteínas produzidas de forma ectópica e constitutiva. As células silenciadas para CDK9 apresentarem um perfil de progressão ao longo do ciclo celular alterado mediante danos ao DNA. Entretanto, tanto a sensibilidade ao

Ministério da Saúde Instituto Nacional de Câncer Coordenação de Pós-graduação

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tratamento com radiação ionizante e inibidores de PARP se mostraram fenótipos independentes de CHK2. Observamos também que os níveis de PLK1 são regulados negativamente em células interferidas para CDK9, mas não em células deficientes para CHK2, e a atividade de transativação transcricional de CDK9 parece ser menor em células deficientes para CHK2. Adicionalmente, novos parceiros de interação de CDK9 foram identificamos no contexto de danos ao DNA através de rotinas de TAP-MS. Coletivamente, nossos dados estabelecem um papel para CDK9 na RDD através do reparo por HR e pelo controle do ciclo celular, bem como sugerem uma putativa função, não relacionada ao reparo, para a interação com CHK2