Avaliação de micrornas relacionados com a sensibilidade ao tratamento em amostras de tumores de Wilms

Abstract

Introdução: O tumor de Wilms (TW) é um tumor embrionário renal que apresenta histologia trifásica composta pelos componentes blastematoso, estromal e epitelial; essa heterogeneidade histológica se relaciona com o comportamento clínico. A identificação de biomarcadores com valores prognósticos auxiliam a orientação do tratamento adequado. Os microRNAs foram relacionados com a tumorigênese em alguns tumores pediátricos. Mutações em genes que fazem parte da maquinaria de biogênese de microRNAs, identificadas em TW com predomínio do componente blastematoso, resultaram na redução da expressão global dos microRNAs. Objetivo: Avaliar a presença de mutações em genes que fazem parte da biogênese dos microRNAs e caracterizar o perfil de expressão global dos microRNAs no componente blastematoso resistente e sensível ao tratamento em TW. Casuística e métodos: Amostras de tumor primário e de metástase provenientes de casos de TWs diagnosticados entre 2003 e 2014 foram avaliadas quanto ao perfil mutacional em casos com (16 casos) e sem recaída (17 casos) e quanto ao padrão de expressão de microRNAs considerando casos resistentes (com o predomínio do componente blastematoso, n=8) e sensíveis (outras histologias, n=12). O DNA foi extraído de três amostras tumorais e da metástase proveniente dos casos com e sem recaída para avaliar o perfil mutacional dos genes DROSHA, DICER1, DGCR8 e SIX1/2. Para realizar a análise da expressão global dos microRNAs, o componente blastematoso foi macrodissecado dos casos resistentes e sensíveis. Após a extração do RNA e avaliação da qualidade, as amostras foram hibridizadas na plataforma GeneChip® miRNA 4.0 Array (®Affymetrix) que avalia a expressão de pequenos RNAs não codificantes (sncRNAs), incluindo os microRNAs. Os dados foram normalizados por RMA (robust multi-array average), utilizando p<0,05 como critério de expressão diferencial. A análise dos dados de expressão global foi realizada em ambiente R usando o pacote limma (Linear Models for Microarray). miRWalk versão 2.0 foi utilizada para identificar genes alvos validados dos microRNAs diferencialmente expressos (DE). Os alvos validados foram caracterizados funcionalmente por ontologia, vias biológicas, doenças e drogas a partir dos bancos Gene Ontology, KEGG e GLAD4U usando as plataformas WebGestalt e DAVID (p ajustado<0,05). Resultados: Dez casos apresentaram mutações nos genes DROSHA, DGCR8 e SIX1, dos quais cinco recaíram; em um caso foram identificadas mutações tanto nas amostras de tumor primário quanto da metástase. A heterogeneidade intratumoral foi identificada em quatro casos que recaíram. A expressão diferencial dos sncRNAs foi explorada em três análises comparativas: tumor versus rim normal adjacente ao tumor, casos com e sem mutação e casos resistentes versus sensíveis, sendo identificados 932, 522 e 37 sncRNAs DE, respectivamente. Dos 37 sncRNAs DE, 16 (43,2%) são miRNAs maduros. Os alvos validados dos microRNAs DE (4.079 genes) foram enriquecidos em vias relacionadas com resistência a drogas, proliferação celular e progressão tumoral assim como processos biológicos relacionados com a regulação da expressão gênica. As análises de enriquecimento também mostraram doenças relacionadas com câncer e drogas usadas como parte dos protocolos de tratamento de TW. Conclusões: Mutações em genes que fazem parte da biogênese dos microRNAs e em SIX1 estão associadas a heterogeneidade intratumoral e as análises de expressão diferencial de microRNAs sugerem que o componente blastematoso de TW resistente ao tratamento tem um perfil de expressão de miRNA específico.