Metilação e expressão de genes HOXA na mielofibrose primária

Abstract

Mielofibrose primária (MFP) é uma neoplasia mieloproliferativa originária de uma célula tronco hematopoética que apresenta mutação somática no gene JAK2, CALR ou MPL, o que leva à ativação constitutiva da via JAK / STAT. Outras mutações somáticas co-ocorrem principalmente em genes envolvidos na regulação epigenética, como TET2 e ASXL1. ASXL1 pertence ao grupo de genes ETP (Enhancer of trithorax e Polycomb), que codificam proteínas necessárias para a manutenção da ativação e da repressão de genes alvo tais como os genes HOX. O objetivo deste estudo foi analisar o estado de metilação e expressão gênica de genes HOXA na MFP. Para isso, foram avaliados diferentes contextos biológicos: linhagens de células tronco de pluripotência induzida (iPSC) e corpos embrióides (EB) derivados in vitro; células tronco hematopoéticas (CTH) e granulócitos (GR) derivados in vitro; e granulócitos primários de sangue periférico. O estado de metilação foi estudado por sequenciamento direto após conversão do DNA com bissulfito de sódio seguido de reação em cadeia da polimerase (PCR). Já a expressão gênica foi quantificada por qRT-PCR usando o intercalante de DNA SYBR Green. No estudo das células embrionárias, observamos que nas iPSC, tanto derivadas de MFP quanto CNT, as regiões analisadas em HOXA6 e HOXA9 estavam parcialmente metiladas, enquanto HOXA 10, 11 e 13 estavam desmetiladas. Ao longo da diferenciação de iPSC para EBs houve uma diminuição da metilação de HOXA6 em células CNT, mas não em MFP. A maioria dos sítios CpG avaliados para HOXA9 estavam desmetilados nos EBs. Com relação à expressão gênica, HOXA6 pareceu estar mais expresso nas iPSC-MFP, quando comparado às iPSC-CNT, enquanto HOXA9 pareceu estar mais expresso nos EBs-MFP, quando comparado aos EBs-CNT. Em seguida, na análise da hematopoese, verificamos que HOXA6 apresentou-se parcialmente metilado nas CTH-CNT e desmetilado nas CTH-MFP. No entanto, ao fim da diferenciação in vitro, essa região estava parcialmente metilada tanto nos granulócitos CNT quanto nos MFP. Finalmente, avaliamos a metilação de HOXA em granulócitos primários de pacientes MFP, portadores de ASXL1 selvagem ou mutado. Os genes HOXA 7-13 estavam desmetilados e HOXA6 foi o único a apresentar CpGs parcialmente metiladas. Não foram encontradas diferenças significativas na expressão gênica de HOXA6-13 ou ASXL1, quando comparados granulócitos primários de pacientes ASXL1WT ou ASXL1mut. Assim, os resultados obtidos nesse trabalho permitiram a identificação de algumas diferenças na metilação de HOXA entre células derivadas de MFP e CNT, concordantes com o observado em estudos que detectaram sitios CpG diferencialmente metilados nos granulócitos primários e CTH de pacientes MFP ASXL1 mutado ou selvagem quando comparados com granulócitos e CTH CNT. Indicando que dentro de cada tipo de célula individual, diferentes padrões de metilação do DNA, que possam ter uma contribuição específica para a patogênese da doença. Em outro estudo com CTH humanas portadoras de mutações de perda de função em ASXL1 observou-se um aumento de expressão de genes associados a leucemogenesis como os HOXA5-9. Futuramente, os achados desse trabalho deverão ser verificados em outros modelos, para avaliação do possível efeito das mutações em ASXL1 no estado epigenético de HOXA.