Análise do retinoblastoma com painel de 160 genes

Abstract

O retinoblastoma é um tumor maligno da infância, ocorrendo geralmente antes dos cinco anos de idade. As alterações do gene RB1 são a principal causa, sendo ambos os alelos afetados nos retinoblastos, apesar de uma pequena parte dos tumores ser de etiologia incerta. A maioria das mutações constitutivas no RB1 consiste em substituições de um ou poucos nucleotídeos, porém, em cerca de 15% dos casos podem ocorrer grandes deleções ou amplificações, que podem se estender a toda a região cromossômica 13q14 onde o RB1 está localizado. Estes grandes rearranjos podem não ser identificados por sequenciamento de Sanger, mas são detectados pelo Multiplex Ligation Probe-dependent Amplification (MLPA). Neste trabalho foram analisadas por MLPA 61 amostras de DNA de sangue que não tinham apresentado alterações por sequenciamento de Sanger no Programa de Aconselhamento Genético em Câncer do Instituto Nacional de Câncer (INCA). Esta análise mostrou que 57 dessas amostras não apresentavam alterações. Onze dessas amostras possuíam amostras pareadas de DNA tumoral que foram adicionadas a outras 48 amostras tumorais de pacientes cujas amostras pareadas de sangue previamente analisadas não tinham mostrado mutações no RB1 ou alterações detectadas por MLPA. A integridade das 59 amostras tumorais, testada por qPCR, selecionou 24 para posterior análise com suas respectivas amostras pareadas de DNA de sangue. Os 24 pares de amostras foram analisados com um painel de 160 genes (contendo RB1 + outros 159 genes) por sequenciamento de nova geração (NGS). As variantes encontradas foram classificadas segundo critérios do American College of Medical Genetics and Genomics. Esta análise mostrou 136 mutações patogênicas em 63 genes, sendo 103 descritas pela primeira vez. No RB1 foram encontradas: duas mutações constitutivas patogênicas devido a maior sensibilidade do NGS em relação ao sequenciamento de Sanger previamente utilizado, 11 alterações somáticas patogênicas e 15 variantes do RB1 de significado incerto (VUS). O número de mutações em outros 62 genes encontrou-se significativamente associado à presença do RB1 mutado e a tumores unilaterais. A distribuição de mutações mostrou ser muito desigual entre pacientes e sete pacientes não mostraram mutações patogênicas. BCOR apresentou-se mutado somente em amostras tumorais com mutação no RB1, e BRAF somente em tumores sem mutação no RB1. TSC1 e MAP2K1 apresentaram-se mutados somente em tumores de pacientes com apresentação bilateral. Análise das vias biológicas mostrou que os genes mutados participavam de vias de transdução de sinal e transcrição gênica. Em relação a variações do número de cópias (CNV), todos os genes do painel apresentaram alterações (deleções ou amplificações) em, no mínimo, 30% das amostras tumorais. Foram encontradas cinco deleções completas do RB1 confirmadas por MLPA nas amostras tumorais. Nos outros 159 genes, a amplificação foi o evento mais frequente de CNV nos tumores. Conjuntos significativamente diferentes de genes encontraram-se amplificados em tumores de pacientes com ou sem mutação no RB1. Em relação a deleções, a deleção do gene CRLF2 foi mais frequente em tumores com mutação no RB1. Os achados deste estudo contribuirão ao Programa de Aconselhamento Genético em Câncer do INCA.