Detecção de Variantes nos genes MSH2, MSH6, MLH1 e PMS2 utilizando Sequenciamento de Nova Geração

Abstract

A Síndrome de Lynch (SL) é uma herança autossômica dominante de alta penetrância, que atinge aproximadamente 3% dos pacientes com câncer colorretal. Os indivíduos acometidos apresentam mutações germinativas em um dos genes responsáveis pelo reparo de DNA por mal pareamento (Mismatch Repair- MMR): MSH2, MLH1, MSH6 ou PMS2. Por serem genes longos, a identificação de mutações nestes genes se torna demorada e com custo elevado. Desta maneira, o projeto teve como objetivo padronizar uma estratégia de identificação de variantes que permitisse reduzir os custos e tempo de rastreamento molecular dos genes MMR. Para isso, foram padronizadas 16 reações de PCRs-multiplex para os genes MSH2, MLH1 e MSH6 e 5 reações de PCRs de longo alcance para o gene PMS2. Estes produtos foram sequenciados utilizando a tecnologia de Nova Geração (NGS), através do equipamento HiSeq2500. A estratégia foi validada através do sequenciamento pelo método de Sanger dos

genes de MMR em 66 pacientes, provenientes de quatro centros distintos do Brasil (INCA- RJ, HCPA- RS, HJUBB- PA e ACCAM- SP), e que preencheram os critérios de Bethesda

para SL. As profundidades médias de cobertura obtidas para os genes MSH2, MSH6, MLH1 e PMS2 foram de 7.988, 36.313, 11.899 e 4.772 vezes, respectivamente. Foram identificadas 98 alterações em éxons e íntrons dos quatro genes, sendo que 25 eram patogênicas ou VUS (7 em MSH2, 5 em MSH6, 12 em MLH1 e 1 em PMS2) e foram encontradas em 32 pacientes. A estratégia padronizada foi eficaz na identificação de variantes dos genes MMR, permitiu reduzir em três vezes o número de reações de PCR realizadas por amostra e em 2,15 vezes o custo de rastreamento molecular para os quatro genes MMR. Dos fragmentos sequenciados, 3,1% apresentaram profundidade média de cobertura <30X e não foram eficientes na detecção de sítios variáveis nos genes MMR.