Please use this identifier to cite or link to this item: https://ninho.inca.gov.br/jspui/handle/123456789/12290
Full metadata record
DC FieldValueLanguage
dc.contributor.advisorBonamino, Martín Hernán-
dc.contributor.authorGomez, Cintia Elisabeth-
dc.date.accessioned2023-01-12T18:17:44Z-
dc.date.available2023-01-12T18:17:44Z-
dc.date.issued2018-
dc.identifier.citationGOMEZ, Cintia Elisabeth. Células tronco de pluripotência induzida (IPSCS) como modelo de estudo de mutações somáticas das neoplasias mieloides. 2018. Tese (Doutorado em Oncologia) - Instituto Nacional de Câncer, Rio de Janeiro, 2018.pt_BR
dc.identifier.urihttps://ninho.inca.gov.br/jspui/handle/123456789/12290-
dc.description220 p.: il. color.pt_BR
dc.description.abstractA mielofibrose primária (MF) é caracterizada por uma mieloproliferação aumentada e fibrose da medula óssea. Na MF, as mutações somáticas driver ocorrem nos genes JAK2, MPL ou CALR e mutações em reguladores epigenéticos como TET2 e ASXL1, que podem levar à perda de função. Neste contexto, as células tronco de pluripotência induzida (iPSCs) podem ser usadas para estudar a heterogeneidade clonal, recapitular in vitro o fenótipo da doença e em testes para a eficácia de fármacos. O objetivo principal deste trabalho foi avaliar o impacto das mutações somáticas na CALR e nos reguladores epigenéticos tanto na reprogramação celular como na diferenciação hematopoiética usando iPSCs. As mutações em CALR foram caracterizadas por PCR e eletroforese capilar, e as mutações somáticas nos outros genes foram caracterizadas pelo sequenciamento de próxima geração. Neste estudo, geramos células iPSC a partir de células primárias CD34+ de pacientes (P) nomeados de P1 a P6 e dois controles de doadores saudáveis (C1/C2) usando o sistema baseado em vírus Sendai. O estado de pluripotência foi avaliado pela expressão de marcadores de células estaminais embrionárias (OCT-3/4, Sox-2, SSEA-4 e TRA-1-81) e a capacidade de se diferenciar em todas as três camadas germinativas nos ensaios de formação de corpos embrioides. Os marcadores de células-tronco e das camadas germinativas foram detectados por imunofluorescência. A diferenciação hematopoiética foi realizada em culturas feeder-free, suplementada com citocinas. Os progenitores CD43+ CD34+ foram classificados no dia 10 e 14 e plaqueados em metilcelulose ou em ensaios de coagulação plasmática para quantificar unidades de formação de colônias (CFU) ou CFU-megacariocítica (CFU-MK), respectivamente. Os granulócitos foram diferenciados dos progenitores CD34+ /CD43+ durante uma cultura de 25 dias. Após a reprogramação, realizamos uma caracterização molecular dos iPSCs derivados de P1-P6. A partir de P4, foram obtidos 32 clones de iPSCs e foram identificados dois genótipos diferentes, CALRins5/ TET2wt (n = 20) e CALRins5/TET2G989X (n = 12). Os diferentes genótipos observados para P4-iPSC refletem a diversidade clonal presente na amostra primária de MF. Confirmamos que TET2 WT, bem como o iPSCs carreando TET2 mutado formam bona fide iPSCs, indicando que a mutação G898X não prejudicou a reprogramação celular. Procuramos, em seguida, estudar o papel dessas mutações na diferenciação hematopoiética. O potencial clonogênico dos progenitores foi confirmado pela formação de todos os tipos de CFU mieloide em ensaios de metilcelulose. Usando o teste do coágulo de plasma, observamos maiores números de colônias grandes CFU-MK (> 50 células) derivadas de clones P1-iPSC vs C1/C2-iPSC. Além disso, observamos um número crescente de colônias de monócitos derivadas de progenitores CD34+ /CD43+ de iPSCs mutantes TET2 (CALRins5/TET2G989X) quando comparados com iPSCs CALRins5/TET2WT e iPSC do doador controle CALRWT/TET2WT. Além disso, os iPSCs portadores de CALR mutante foram associados a colônias de MK maiores consistentes com o fenótipo observado em pacientes com MF. Neste estudo, nossos resultados sugerem que mutações em reguladores epigenéticos como o TET2G898X não parecem prejudicar a reprogramação celular, já que os iPSCs que abrigavam essas mutações apresentavam todas as características dos bona fide iPSC e que as mutações em CALR e TET2 parecem afetar a diferenciação hematopoiética de iPSCs.pt_BR
dc.language.isoporpt_BR
dc.subjectMielofibrose Primáriapt_BR
dc.subjectPrimary Myelofibrosispt_BR
dc.subjectMielofibrosis Primariapt_BR
dc.subjectGenes Reguladorespt_BR
dc.subjectGenes, Regulatorpt_BR
dc.subjectEpigênese Genéticapt_BR
dc.subjectEpigenesis, Geneticpt_BR
dc.subjectEpigénesis Genéticapt_BR
dc.titleCélulas tronco de pluripotência induzida (iPSCs) como modelo de estudo de mutações somáticas das neoplasias mieloidespt_BR
dc.TypeThesispt_BR
dc.contributor.advisorcoMonte-Mór, Bárbara da Costa Reis-
dc.contributor.memberMaia, Raquel Ciuvalschi-
dc.contributor.memberPanepucci, Rodrigo Alexandre-
dc.contributor.memberPereira, Renata Mierelles-
dc.contributor.memberLeal, Fabio Eudes-
dc.contributor.memberVasconcelos, Zilton Farias Meira de-
dc.contributor.memberLamas, Marcelo Einicker-
dc.degree.grantorINCApt_BR
dc.degree.departmentCOENSpt_BR
dc.degree.programOncologiapt_BR
dc.degree.localRio de Janeiropt_BR
dc.terms.abstractPrimary myelofibrosis (PMF) is characterized by an increased myeloproliferation and bone marrow fibrosis. In PMF, driver somatic mutations occur in JAK2, MPL or CALR genes and mutations in epigenetic regulators as TET2 and ASXL1 that could lead to loss-of-function. In this context, induced pluripotent stem cells (iPSC) could be used to study clonal heterogeneity, recapitulate in vitro the disease phenotype and test for drug efficacy. The main goal of this work was to assess the impact of somatic mutations in CALR and epigenetic regulators in both cellular reprogramming and hematopoietic differentiation using iPSCs. CALR mutations were characterized by PCR and capillary gel electrophoresis, and the somatic mutations in the others genes were characterized by Next Generation sequencing. In this study, we generated iPSC cells from CD34+ primary cells from patients (P) called from P1 to P6 and two healthy donor control (C1/C2) using the Sendai virus based system. The pluripotency status was evaluated by the expression of embryonic stem cells markers (OCT-3/4, Sox-2, SSEA-4 e TRA-1-81) and the capacity to differentiate into all three germ layers in embryonic body formation assays. Stem cell and layer specific markers were detected by immunofluorescence. Hematopoietic differentiation was performed on feeder-free culture supplemented with cytokines. CD43+CD34+ progenitors were sorted at day 10 and plated either in methylcellulose or in plasma clot assays to quantify myeloid Colony-Forming Units (CFU) or CFU- Megakaryocytes (CFU-MK), respectively. Granulocytes were differentiated from CD34+ /CD43+ progenitors during a 25 day-culture. After reprogramming, we performed a molecular characterization of the iPSCs derived from P1-P6. From P4, 32 P4-iPS clones were obtained and two different genotypes were identified, CALRins5/TET2wt (n=20) and CALRins5/TET2G989X (n=12). The different genotypes observed for iPSCs reflect the clonal diversity present in the PMF primary sample. We confirmed that TET2WT as well as TET2 mutated iPSCs were bona fide iPSCs, indicating that G898X mutation did not impair cellular reprogramming. We next sought to study the role of these mutations in the hematopoietic differentiation. The clonogenic potential of progenitors was confirmed by formation of all type of myeloid in methylcellulose assays. Using plasma clot assay, we observed higher numbers of large CFU-MK colonies (>50 cells) derived from P4-iPSC clones vs C1/C2-iPSC. Moreover, we observed an increased number of monocyte colonies derived from CD34+ /CD43+ progenitors of TET2 mutated (CALRins5/TET2G989X) iPSCs when compared with iPSCs CALRins5/TET2WT and iPSC from control CALRWT/TET2WT donor. In addition, iPSCs carrying mutated CALR were associated with larger MK colonies consistent with the phenotype observed in PMF patients. In this study, our results suggests that mutations in epigenetic regulators such as TET2G898X did not seem to impair cellular reprogramming, since iPSCs harboring these mutations displayed all the features of bona fide iPSC and that mutations in CALR and TET2 seem to impact hematopoietic differentiation of iPSCs.pt_BR
Appears in Collections:Teses Defendidas no INCA

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Células tronco de pluripotência induzida (iPSCs).pdf15.96 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.