Avaliação funcional do impacto de variantes de sentido trocado e geradas por inserções e/ou deleções que respeitam o quadro de leitura na proteína BRCA1

Abstract

BRCA1 (Breast Cancer 1, early onset) foi o primeiro gene relacionado à susceptibilidade ao câncer de mama e ovário. Seu produto proteico homônimo desempenha um papel central na resposta ao dano de DNA (RDD). BRCA1 encerra um domínio coiled-coil e dois domínios BRCT (BRCT1 e BRCT2) em tandem (tBRCT) em sua região C-terminal, separados por uma região desestruturada. Os domínios BRCT, quando em tandem, se comportam como uma única unidade estrutural. Esse domínio é crucial para a supressão tumoral mediada por BRCA1, tendo em vista que a perda de 11 resíduos de aminoácido na borda C-terminal da proteína resulta na predisposição ao câncer. Logo, variantes sem sentido (nonsense) ou que alteram o quadro de leitura codificante são geralmente classificadas como patogênicas. A interpretação do impacto de variantes de sentido trocado (missense) e de pequenas deleções e/ou inserções (indels) que respeitam o quadro de leitura da proteína não é simples. Essas variantes, em especial aquelas com baixa frequência na população, tendem a ser classificadas como variantes de significado incerto (Variants of Uncertain Significance; VUS). Estudos funcionais representam uma poderosa ferramenta na determinação do impacto de VUS na funcionalidade da proteína. Nosso grupo demonstrou que a integridade do domínio tBRCT de BRCA1 está diretamente relacionada à sua capacidade de ativar a transcrição quando fusionada a um domínio heterólogo de ligação ao DNA (ensaio de TA). Nos últimos anos, foram avaliadas mais de 300 variantes missense localizados na porção C-terminal de BRCA1 (região compreendida entre os resíduos de aminoácido 1396 e 1863, codificados pelos éxons 13 ao 24) através dessa ferramenta. Contudo, pouco se sabe sobre o impacto funcional de indels que respeitam o quadro de leitura localizadas na região C-terminal de BRCA1. Nosso estudo tem foco na caracterização do impacto funcional dessas variantes, bem como na avaliação da importância da borda C-terminal do domínio BRCT2 para manutenção da integridade do domínio tBRCT. Indels previamente reportadas na população foram identificadas através do banco de dados disponível na plataforma BRCA Exchange. Nós selecionamos e geramos 16 variantes localizadas entre os éxons 13 e 24 de BRCA1. Também foram geradas 6 variantes nonsense na porção C-terminal do domínio tBRCT. Essas variantes foram analisadas funcionalmente através do ensaio de TA, conduzido em células humanas da linhagem HEK293FT, e os níveis proteicos avaliados através de rotinas de immunoblotting. As variantes localizadas no domínio tBRCT atividade transcricional inferior à 50% do controle selvagem. No entanto, as variantes localizadas na região desestruturada apresentam atividades que variam entre 50% e 160% do comportamento do controle. Interessantemente, a perda de um único resíduo de aminoácido na borda C-terminal do BRCT2 (p.Y1863) resulta na redução de 50% da atividade. Esse comportamento é mantido até a perda do quinto resíduo estudado (p.P1859). A deleção de resíduos adicionais é acompanhada por uma redução significativa da atividade transcricional. Coletivamente, nossos dados mostram o valor de interrogar o impacto funcional dessas variantes. Uma melhor compreensão do seu comportamento é a chave para a compreensão da organização e funções estruturais do tBRCT de BRCA1.