Caracterização funcional da isoforma 55K da proteína CDK9 na resposta ao dano no DNA

Abstract

A resposta ao dano no DNA (RDD) é crucial para manutenção da estabilidade genômica. Disfunções em proteínas envolvidas nessas vias podem culminar na tumorigênese. Para compreender as vias de RDD, nosso grupo elaborou um estudo sistemático para identificar novas proteínas envolvidas na RDD. Nosso trabalho prévio identificou a cinase dependente de ciclina 9 (CDK9) como um putativo interator das proteínas BRCA1, BARD1 e PTIP. CDK9 apresenta duas isoformas, a isoforma 42k atua na etapa de elongamento da transcrição e na recombinação homologa (através de sua interação com BRCA1 e BARD1). No entanto, o papel da isoforma 55k permanece pouco explorado. Nesse trabalho, investigamos as diferenças funcionais entre CDK9 42k e 55k, explorando um possível papel da isoforma 55k na via de reparo por recombinação não homóloga por junção de extremidades (NHEJ). Para examinar um possível comportamento ciclo dependente, avaliamos os níveis de CDK9 em células das linhagens hTERT-BJ e MCF7 sincronizadas. Os níveis da isoforma 55k (mRNA e proteína) foram observados aumentados na fase G1. Assim, avaliamos a dinâmica do ciclo celular em células MCF7 proficientes e deficientes para CDK9, superexpressando CDK9 42k ou 55k tratadas com radiação ionizante (IR). Um fenótipo de arresto de ciclo celular na fase G1 foi observado somente nas células CDK9 55k. Também avaliamos o efeito de quimioterápicos (cisplatina, etoposídeo e irinotecano) em células MCF7 deficientes para CDK9 e reconstituídas com as isoformas 42k ou 55k. As células CDK9 55k apresentaram um aumento significativo na viabilidade celular quando comparadas às células CDK9 42k. A putativa associação entre CDK9 e PTIP foi avaliada por de rotinas de GST-pulldown e de coimunoprecipitação. Dados preliminares indicaram uma interação seletiva entre CDK9 55k e PTIP. Esses resultados nos levaram a investigar o papel das isoformas de CDK9 na RDD, seguindo a via de NHEJ. Após o tratamento com IR, células CDK9 42k exibiram um padrão de focos induzido por radiação ionizante (IRIF) característico, em contraponto às células CDK9 55k que mantiveram uma localização difusa nuclear. Também investigamos o padrão de IRIF de 53BP1, diferentemente da superexpressão de CDK9 42k que não teve impacto na formação de focos, a isoforma de 55k mostrou um aumento significativo. Em conjunto, nossos dados sugerem que o CDK9 55k desempenha um papel no controle do ciclo celular e na via NHEJ.