Screening de proteínas com potenciais interações com o receptor inibitório Lymphocyte-Activation Gene 3 (LAG-3)

Abstract

Receptores inibitórios como PD-1, LAG-3, TIM-3 e CTLA-4 ganharam atenção especial como potenciais alvos para imunoterapia, uma vez que a manipulação de sinais negativos mediados por esses receptores pode fornecer novos alvos terapêuticos para várias doenças, inclusive câncer. Mais recentemente, Lymphocyte activation gene-3 (LAG-3) foi descrito como uma molécula de superfície celular que interage com moléculas de MHC de classe II e a identificação de como as proteínas transduzem o sinal desses receptores tem sido um desafio. Técnicas como Imunoprecipitação e a mais recentemente descrita, denominada BioID, são técnicas que podem auxiliar significativamente na identificação das interações proteína- proteína e, desta forma, na descoberta de proteínas essenciais para a ativação de determinada via de sinalização. Objetivo: Realizar um screening de proteínas que interagem com LAG-3 através das técnicas de Imunoprecipitação e BioID. Metodologia: os receptores de antígenos quiméricos (CARs) foram construídos com o scFv anti-CD20 fundido com os domínios intracelulares consistindo de: Lag-3 WT, Lag-3KMUT (K => mutação A no domínio KIEELE), Lag3 EPdel (domínio EP deletado), todos fusionados ao domínio BirA, com posterior indução da expressão destes CARs nas linhagens celulares HEK293T e MOLT4(linfócitos T CD4 +). Análise por citometria de fluxo, imunofluorescência e western blot foram feitos para avaliar a expressão e presença dos CARs. Após a imunoprecipitação das proteínas em beads conjugadas a streptavidina (BioID) e beads revestidas por proteína G (IP), as proteínas foram eluídas e submetidas a análise por espectrometria de massas. Posteriormente, análises in silico de possíveis vias de sinalização envolvidas downstream a LAG-3 foram realizadas com base nas proteínas marcadas identificadas no

espectrometro de massas. Resultados: Receptores baseados em CAR foram sintetizados e clonados no vetor pcDNA3.1 MCS- BirA (R118G) -HA, em sequência com o domínio BirA. O CAR anti-CD20 / Lag3Wild foi eletroporado na linhagem celular MOLT4

e transfectado na linhagem HEK293T; nesta última, as demais construções também foram transfectadas, e a expressão e presença dos CARs foi verificada por citometria de fluxo, imunofluorescência e Western blot. Para a técnica de BioID em MOLT4, a análise do padrão de biotinilação para o CAR anti-CD20 / Lag3Wild revelou o padrão de biotinilação esperado. Contudo, foi verificada necessidade de otimização tanto da técnica BioID quanto IP em células T. Já a realização da IP em células HEK293T revelou que as proteínas EEF1G, DYNC1H1, PTBP1,FASN e DERL1 estavam presentes exclusivamente na condição LAG-3WT, quando esta foi comparada com as condições EPDEL e KMUT. Além disso, o ensaio mostrou que as proteínas PDIA4, SDF4 e HEL-S-269 estavam presentes exclusivamente na lista da condição LAG3WT, quando esta foi comparada com as condições KMUT e DMUT. A análise das vias de sinalização enriquecidas com base nas proteínas exclusivamente encontradas em cada condição, entre a condição CAR LAG3WT versus controle, mostrou que as vias de processamento de proteínas no retículo endoplasmático, de biossíntese de N- glicanos e exporte de proteínas foram encontradas como enriquecidas. Quando todas as condições foram consideradas para esta mesma análise simultanamente- considerando- se somente as proteínas únicas presentes em cada condição-, foi observado que a via de processamento de proteínas no retículo endoplasmático esteve presente como enriquecida em quase todas as condições, assim como vias de processamento de N- glicanos e exporte de proteínas. Na condição KMUT, a via da interleucina 17 (IL-17) também foi foram como enriquecida. Ainda, a via de exporte de

proteínas também esteve presente para a condição KMUT e também na DMUT, sendo que nesta última, a de síntese de N- glicanos também foi observada, novamente nos levando a inferir uma possível correlação entre a necessidade de glicosilação

de LAG-3 para sua função inibitória.Conclusão:. Em relação a técnica de BioID, é possível também observar pela técnica de western blot o padrão de biotinilação esperado entre amostra e controles. A análise das amostras seguindo os protocolos de IP e BioID por espectrometria de massas nos revelou algumas proteínas que provavelmente estão diretamente envolvidas com a função de LAG-3. Perspectivas: realizar a edição através da técnica de CRISPR/Cas9 das possíveis proteínas essenciais a LAG-3 encontradas após análise das amostras por espectrometria de massas. Uma vez realizados tais ensaios funcionais, pretende-se realizar os mesmos novamente, mas usando modelos in vivo.